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說一說T100基因擴(kuò)增儀由哪三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成

更新時(shí)間:2021-06-25      瀏覽次數(shù):1557
   T100基因擴(kuò)增儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備,能在95℃,55℃,72℃之間很好地進(jìn)行溫度控制。
 
  本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增,加熱使雙鏈DNA解開螺旋,在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交,在TaqDNA聚合酶,dNTPs,Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物,重復(fù)“變性→退火→引物延伸”過程至25~40個(gè)循環(huán),呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)。
 
  擴(kuò)增時(shí)加入的引物利用熒光素進(jìn)行標(biāo)記,使引物和熒光探針同時(shí)與模板進(jìn)行特異性結(jié)合,擴(kuò)增結(jié)果通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)并輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng),實(shí)時(shí)輸出量化結(jié)果,這樣的PCR儀叫實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
 
  T100基因擴(kuò)增儀的操作非常簡(jiǎn)便,接通電源,儀器自檢,設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲(chǔ)存的程序運(yùn)行即可。
 
  T100基因擴(kuò)增儀技術(shù)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。
 
  1、模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。
 
  2、模板DNA與引物的退火:模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。
 
  3、引物的延伸:DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
 
  重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一輪循環(huán)需2~4分鐘,如此反復(fù)進(jìn)行,每一輪循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一輪循環(huán)的模板,每一輪循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增1倍,PCR產(chǎn)物以2的指數(shù)形式迅速擴(kuò)增,經(jīng)過25~30輪循環(huán)后(2~3小時(shí)),理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上,實(shí)際上一般可達(dá)106~107倍。

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